Ензимът инвертаза (наричан още захараза) разгражда захарозата до глюкоза и фруктоза. Получава се инвертна захар, откъдето идва и името на ензима.
Наименованието на инвертазата по ензимната номенклатура е вета-D-фруктофуранозид-фруктохидролаза.
Дрождите (в частност хлебните) имат способността да натрупват в клетките си големи количества ензим, поради което може да се използват като източник за получаване на препарат на инвертаза. За целта обаче е необходимо дрождевите клетки да се поставят при условия, при които единствен компонент на хранителната им среда е захарозата. Това води до индуциране на образуването на инвертаза и до нейното натрупване в големи количества.
Ензимът е вътрешноклетъчен и се натрупва между клетъчната стена и клетъчната мембрана. За да се изолира, е необходимо да се разруши клетъчната стена. Това може да стане чрез механично стриване на клетките; чрез автолиза (при 45° С за 2 h); чрез обработка с толуол или с бензол; чрез обработка с ултразвук; при дълбоко замразяване с течен азот; чрез дезинтеграция (метод за разрушаване целостта на микробните клетки с помощта на специални апарати (дезинтегратори). След разрушаването на клетъчната стена и отделянето на биомасата ензимът остава в разтвора. Разтворът може да се използва като готов препарат на инвертаза, но е много разреден и е необходимо да се концентрира или ензимът да се утаи чрез различни методи. Най-често се прилага утаяване с етилов алкохол. Утаеният белтък, който съдържа ензима инвертаза, се отделя чрез центрофугиране и се разтваря в дестилирана вода, към която се прибавя глицерол. Целта е да се повиши стабилността на ензима. В разтвор на глицерол препаратът на инвертазата може да се съхранява до 18 месеца в хладилник с минимални загуби на активността му.
Указания за практическа работа:
А/ Необходими материали: Хлебни дрожди, захароза, кварцов пясък, дестилирана вода, 96°-ов етанол, глицерол, 10% NaOH, 5% CuSO4.
Б/ Ход на опита: В конични колби от 300 ml се поставят по 30 g хлебни дрожди и се суспендират с 30 ml 20%-ов разтвор на захароза. Добре е колбите да се поставят на клатачка за около 1,5 h (ако няма клатачка, необходимо е суспензията периодично да се разбърква за по-добра аерация). След обогатяването на дрождите с инвертаза, сместа се центрофугира за отделяне на клетките. Те се прехвърлят с малко вода в хаванче, прибавя се кварцов пясък и се стриват около 5—10 min, за да се разрушат клетъчните стени. Сместа се прехвърля в центрофужни епруветки, след което кварцовият пясък и останалата биомаса се смива с вода в същите епруветки.
Центрофугира се за 10 min при 6000 min-1. След отделяне на биомасата течността над утайката внимателно се измерва и се прехвърля в бехерова чаша от 200 ml, поставена в ледена баня. За утаяване на ензима се прибавя внимателно, по стените на чашата и при постоянно разбъркване, 1,5 обема етанол, охладен до —5 °С. След прибавяне на цялото количество етанол сместа се бърка още 10 min и се центрофугира при 1000 min-1 за 10 min. Течността се излива внимателно, получената утайка се разтваря в— 5—6 ml студена дестилирана вода и се прибавят 2—3 ml глицерол. Полученият глицеролов препарат на инвертаза се съхранява в хладилник.
В две епруветки се наливат по 5 ml 10%-ов разтвор на захароза. Към първата се прибавя 1 ml вода, а към втората — 1 ml от получения препарат на инвертаза.
През 10 min се вземат проби и се анализират за редуциращи захари.
Здравословни и безопасни условия на труд
1. NaOH е силно корозивна. Предизвиква тежки изгаряния. Може да предизвика сериозни трайни увреждания на очите. Опасна е при поглъщане, контакт с кожата или при вдишване на прах.
Меден (II) сулфат е опасен при поглъщане.
2. Спазвайте правилата за безопасна работа при нагряване със спиртна лампа.
3. Спазвайте правилата за безопасна работа с електрически уреди.
Въпроси и задачи
1. Защо дрождите се култивират в хранителна среда съдържаща захароза преди да се пристъпи към изолирането на инвертазата?
2. Къде се съдържа ензима? Какъв метод за разрушаването на клетъчната стана на дрождите използвате?
3. Отчетете получените резултати и направете съответните изводи от анализите за наличието на редуциращи захари в пробите.
За любознателните:
Повече за инвертазата ще прочетете от тук.
