Биуретова реакция
Характерна е за всички белтъци. В алкална среда в присъствието на медни соли белтъчните разтвори се оцветяват синьовиолетово. Оцветяването се дължи на образуването на комплексно съединение на медта с пептидните групи (—CO—NH—). Биуретовата реакция се извършва и с продуктите от непълната хидролиза на белтъците — пептони и пептиди.
Биуретовата реакция е положителна при наличието на не по-малко от две пептидни връзки. Интензивността на оцветяването зависи от дължината на пептида и варира от синьовиолетово до червено. Реакцията носи наименованието си от съедининието биурет. То може да бъде получено и от карбамид:
Количественото определяне на белтъци е една от най-често срещаните задачи в лабораторната практика по биохимия. За тази цел са разработени редица методи, в основата на които са цветни реакции на белтъците с различни химични съединения. Наличието на пропорционалност между количеството на белтъка, съдържащ се в изследвания разтвор, и интензивността на оцветяването позволява да се направи количествена оценка на съдържанието на белтък в изследваната проба. Един от най-широко използваните методи за определяне на белтъците е количественото определяне на белтъци с биуретов реактив. Ако към разтвор на белтък се добави разтвор, съдържащ медни йони в алкална среда, се появява синьовиолетово оцветяване, интензивността на което е пропорционална на концентрацията на белтъка.
Указания за практическа работа:
1. Биуретова реакция
А/ Необходими материали: 10% разтвор на NaOH,
1% разтвор на CuSO4, белтъчни разтвори, карбамид
Б/ Ход на анализа:
Предварително се получава биурет, като в суха епруветка се поставя няколко кристалчета карбамид и се нагряват на слаб огън. Карбамидните кристали отначало се стопяват. Когато втечнената маса започне да се втвърдява, нагряването се прекратява и епруветката се оставя да изстине. При загряване от карбамида се получава биурет и се отделя амоняк, който излита. Това се установява или по миризмата, или ако към отвора на епруветката се поднесе влажна червена лакмусова хартийка — тя променя цвета си в син.
Към получения в епруветката биурет се прибавя около 1 ml 10%-ен разтвор на NaOH и се разбърква. Към алкалния разтвор на биурета се прибавят 1 — 2 капки 1%-ен разтвор на CuSO4. При разклащане се получава характерно виолетово оцветяване.
! Трябва да се избягва прибавянето на излишно количество разтвор на меден сулфат, защото синият цвят, който се получава от образувания при тези условия Cu(OH)2, може да замаскира оцветяването на биуретовата реакция.
В контролна епруветка се налива дестилирана вода, а в останалите епруветки се наливат около l ml разтвор на белтък, 1—2 ml разтвор на NaOH и 1—2 капки разтвор на CuSO4. При разклащане се появява виолетово оцветяване.
2. Количествено определяне на белтък с биуретов реактив
А/ Необходими материали: Стандартен разтвор, съдържащ 10 mg/ml албумин, биуретов реактив, 1%-ов разтвор на натриев хлорид, белтъчен
разтвор с неизвестна концентрация.
Б/ Ход на анализа:
Приготвяне на калибровъчна (стандартна) крива: приготвят се три серии от стандартни разтвори, съдържащи от 1 до 10 mg/ml белтък (чрез разреждане на изходния стандартен разтвор). Вземат се от първата серия по 1 ml от всеки стандартен разтвор и се наливат в отделни епруветки. Към всяка епруветка се долива по 4 ml биуретов реактив и се оставяй 30 min при стайна температура. След това се фотометрират в кювети с широчина 10 mm при дължина на вълната 540 nm (за контрола служи дестилирана вода). Определянията се повтарят по същия начин и с другите две серии. От получените стойности на абсорбцията се строи калибровъчна (стандартна) крива. На абсцисата се нанасят стойностите на концентрациите на белтъчните разтвори (1, 2, 3, 4,... 10 mg/ml ), а на ординатата - съответните средни стойности на абсорбцията (А), получени от фотометрирането на трите серии.
Определяне на белтък в изследваната проба: l ml от изследвания белтъчен разтвор се разрежда 10 пъти с 1%-ов разтвор на натриев хлорид. Към l ml от разредения разтвор се прибавя 4 ml биуретов реактив, разбърква се и се оставя 30 min при стайна температура. След това се фотометрира по посочения по-горе метод. Определянето се повтаря още два пъти и се намира средната стойност на абсорбцията от трите определения. От калибровъчната (стандартната) крива се определя съдържанието на белтък в пробата и се изразява в проценти (отчита се разреждането). Изчисленията се извършват по формулата:
където: А е количеството белтък, определено от калибровъчната крива, В е разреждането.
Здравословни и безопасни условия на труд
1. NaOH е силно корозивна. Предизвиква тежки изгаряния. Може да предизвика сериозни трайни увреждания на очите. Опасна е при поглъщане, контакт с кожата или при вдишване на прах.
Меден (II) сулфат е опасен при поглъщане.
2. Амоняка е токсичен. При отравяне с амоняк се препоръчва чист въздух, вдишване на водна пара с прибавка на оцет, пиене на топло мляко. При поражение на кожата, тя се измива с чиста вода и се поставят компреси от 5-процентов разтвор на оцет (или на лимонена киселина).
Въпроси и задачи
1. Отчетете резултатите в табличен вид и направете изводи за съдържанието на белтъци в съответните проби.
2. Възможно ли е и с други качествени реакции да откриете белтъци в биологични течности?
3. Постройте стандартна крива и определете съдържанието на белтък в пробата. При построяването на графиките използвайте компютър и възможностите на Microsoft office.
За любознателните:
Повече за аминокиселините и белтъците на английски език можете да прочетете тук.
Повече за аминокиселините и белтъците на руски език можете да прочетете тук.
